原位杂交精华版

1. 2. 3. 4. 5.

用酒精棉擦干净展片台，升温到50℃。 从－70℃冰箱取出切片，将切片放到展片台上，烘片5min（目的是避免切片形成液滴）。 在切片上滴加4% PFA固定切片1h。。 在染缸中，用1×PBS洗涤，5min/次×2次。 在切片上滴加1% Triton—X100透膜20min。 此期间配预杂交液和杂交液 6. 在染缸中，用1×PBS洗涤，5min/次×3次。

7. 预杂交：在切片上滴加预杂交液（20~100μL/片，视组织的大小而定），要均匀的覆盖在

组织上，室温下在湿盒中静置15min。湿盒是在盒底盛装了预杂交液等渗液的离心管盒。确认盒底等渗液。 8. 杂交：将探针在85℃ PCR仪变性3min后，立即放回冰上静置1min（因此需要在实验开

始时制冰；或者是将铝盒盛装一些水敞口放在－20℃，1h左右即可结冰，并可一直保存）。探针变性后，加到杂交液中，滴加20~50μL/片于切片上，可以选择加盖盖玻片，在湿盒中55℃静置过夜。

严格操作，以防RNA降解。

第二部分

1. 开启水浴锅，设定为55℃，预热。配制

5×SSC（50% 甲酰胺）2份， 2×SSC（50% 甲酰胺）1份， 0.2×SSC（50% 甲酰胺）2份， 0.2×SSC（H2O）1份。

前5个染缸用PE手套套上，放入水浴锅预热洗涤液15min；最后一个在室温放置。 2. 将切片从湿盒取出倾掉杂交液，洗涤：

5×SSC（50% 甲酰胺），55℃，5min； 5×SSC（50% 甲酰胺），55℃，15min； 2×SSC（50% 甲酰胺），55℃，30min； 0.2×SSC（50% 甲酰胺），55℃，30min； 0.2×SSC（50% 甲酰胺），55℃，30min。 3. 0.2×SSC（H2O），室温，5min，去除甲酰胺。 4. 在Buffer1中平衡5min。

5. 将切片放入湿盒，滴加Blocking Solution，确认盒底等渗液，室温封闭1h。 6. 滴加抗体，湿盒中4℃过夜，或室温孵育30min~4h。

第三部分

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

用Buffer1洗涤，5min/次×3次。 用Buffer2平衡，5min。

在切片上滴加显色液，室温显色12h。

经常在显微镜下观察显色情况，以保证适当显色，通常2h~16h。 用灭菌水冲洗干净。

在切片上滴加甲基绿对染，5min。

用灭菌水冲洗干净，直至流下的水无色。 加水或甘油封片，拍照。

附录

1. 实验用品准备：

(1) 载玻片：用铬酸浸泡24h，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，95%酒精浸泡24h，纱布擦

干净，180℃干热灭菌6h以上，2% APES丙酮溶液处理5min，丙酮洗涤5min，灭菌水涮洗2次，烘干备用。 (2) 玻片盒，湿盒：用自来水冲洗，蒸馏水冲洗，100mL 3%双氧水消毒灭菌，55℃烘

箱中烘干，切勿试图湿热灭菌，否则玻片盒会损坏，湿盒会略有变形。 (3) 几个200～500mL的烧杯，10mL、50mL、100mL的量筒，几个100mL的细口瓶

（磨砂盖），3个组织镊，180℃干热灭菌6h以上。 (4) 盖玻片用95%酒精浸泡，纱布擦干净，180℃干热灭菌6h以上 (5) 滤纸：5cm×5cm，几十张，边缘要切整齐，。

(6) 枪头：用超声波清洗器处理3次，15min/次。之后将其中一部分再用0.01% DEPC水浸泡过夜。所有枪头121℃湿热灭菌15min。 (7) DEPC水：0.1%的DEPC水溶液，121℃湿热灭菌30 min。 (8) 灭菌水：蒸馏水121℃湿热灭菌15min。

2. 10×PBS：NaCl 8.18g（1.4M），KCl 0.2g（27mM），Na2HPO4·12H2O 3.58g（100mM），KH2PO4 0.245g（18mM），100mL H2O，PH7.4，高压灭菌，4℃保存。 使用前55℃预热，以使析出结晶溶解。 3. 1×PBS：一次实验用量为150～200mL。用DEPC水稀释10×PBS到1×即可。 4. 4% PFA：1×PBS 20mL，PFA粉末0.8g，在磁力搅拌器上55~60℃加热搅拌直至完全溶解，滤器过滤除菌除杂质，分装为1mL/tube，-20℃冻存。 5. 1% Triton－X100：1×PBS 20mL，TritonX－100 200μL，在磁力搅拌器上55~60℃加热搅

拌直至完全溶解。Triton－X100很粘稠，需用1mL的枪头吸取，按到第二档吸取，按到第一档打出即可；或者用第一档缓慢吸取，第二档打出。 6. 20×SSC：NaCl 17.53g（3M），柠檬酸三钠8.82g（0.3M），100mL H2O，用几滴浓盐酸

调pH至7.0。杂交前的用DEPC水溶解，过滤分装，室温保存；杂交后的用蒸馏水溶解，灭菌，室温保存。 7. 预杂交液：5×SSC（50%去离子甲酰胺），每1mL中加250μL 20×SSC，250μL DEPC水，

500μL去离子甲酰胺，20μL 1% BSA（终浓度0.02%）。临用前每0.5mL预杂交液中加入2.5μL 50mg/mL tRNA（终浓度0.25μg/μL）。对于6张切片来说，通常需要配置1mL预杂交液，为杂交液准备0.5mL。杂交用的湿盒盒底的等渗液为40mL，组分为10mL 20×SSC（灭菌水配制），10mL灭菌水，20mL甲酰胺。 8. 杂交液：0.5mL预杂交液中加硫酸葡聚糖0.05g（终浓度10%），置于55℃烘箱溶解均匀，临用前加入2.5μL 50mg/mL tRNA（终浓度0.25μg/μL）。每100μL杂交液加入一支探针（5~10μL，85℃变性3min后置冰水混合物骤冷1min，终浓度为200~500ng/mL）。 注意，杂交液一半不加探针，阴性对照需要。

9. 1M TrisCl（100mL）：12.1g，pH 7.5和9.5各一份，80mL蒸馏水溶解，用浓盐酸调pH，

定容至100mL； 5M NaCl（100mL）：29.2g，用80mL蒸馏水溶解，定容至100mL； 1M MgCl2（100mL）：20.33g MgCl2·6H2O，用40mL蒸馏水溶解，定容至100mL。 灭菌，常温保存。 10. Buffer1（100mL）：1M TrisCl，pH7.5，10mL；5M NaCl，3mL。蒸馏水定容至100mL。

Buffer2（40mL）：1M TrisCl，pH9.5，4mL；5M NaCl，0.8mL；1M MgCl2，2mL。蒸馏水定容至100mL。

Buffer现用现配，蒸馏水配制，室温保存。 11. Blocking Solution：1%（w/v），称取0.1g Blocking Reagent到小烧杯，加入10mL Buffer1，

放入转子，在磁力搅拌器上以中速搅拌并加热，不要使溶液沸腾（50~60℃）。冷却后分装为1mL/tube，-20℃长期保存，4℃短暂保存。4℃久置会出现沉淀，振荡混匀即可。 12. Antibody Solution：抗体贮存液为抗体原液用无菌的Buffer1 1:25稀释，4℃保存。抗体工作液为贮存液1:200溶于1% Blocking Solution，即抗体的终浓度浓度为1:5000。1mL抗体工作液中加5μL抗体贮存液。 13. 显色液：NBT 4.5μL，BCIP 3.5μL，左旋咪唑5μL，溶于1mL Buffer2中。

NBT：黄色粉末，贮存液浓度为75mg/mL，用70% DMF（即N,N－二甲基甲酰胺）配制。使用终浓度为0.3375mg/mL。

BCIP：白色粉末，贮存液浓度为50mg/mL，用纯DMF配制。使用终浓度为0.175mg/mL。

左旋咪唑：贮存液为2M，用蒸馏水配制。使用时先稀释为0.2M，用Buffer2（或蒸馏水）配制，48mg/mL。使用的终浓度为1mM。

14. 对染液：NaAc·3H2O 1.36g加蒸馏水90mL，用冰乙酸调节pH至4.2，补加蒸馏水至

100mL，加入0.50g甲基绿，氯仿抽提3次以上直至下层无色，去除甲基紫，分离水相备用。在反复抽提中，可能会出现分层不彻底的现象，更换干净的烧杯即可。