怎么设计引物

发布网友 发布时间：2022-04-21 23:07

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热心网友 时间：2023-12-01 17:33

PCR引物又称为寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一对，引物1和引物2。由于DNA聚合酶只能从核苷酸链的5'端到3'端进行复制，也就是只能识别3'的尾端，而且只能把核苷酸连到已经和DNA模板互补产生的多核苷酸链上，所以引物1和2分别于双链DNA的两条链的尾部（就是末尾是3'端的那一边）结合，为那些脱氧核苷酸提供3'的末端，就相当于开了个头。然后在DNA聚合酶的作用下合成两条新链。而那段引物就成了新链的一部分。
其实在生物体内的DNA复制也是这样的一个过程，只是引物是人体自身合成的
引物设计原则
* 序列选取应在基因的保守区段
* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之间的TM相差避免超过2℃
* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
* Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp
* 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

热心网友 时间：2023-12-01 17:33

引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，使DNA聚合酶能从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸。（DNA聚合酶只能从3’端延伸DNA链）。引物有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为 DNA引物）。一般所说引物，指DNA引物。
引物是人工合成的两段一般由15~30个核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的化合物。一个引物与DNA模板链的一端互补，另一个引物与另一条模板链的反向端互补。
引物的设计有一些基本原则，例如引物的GC含量为40%~60%、解链温度最好近72度、碱基要随机分布、引物之间不能有互补序列等等，此外有专门的计算机软件，也有专门的公司里的专门设计人员可以承担这项工作。

参考资料：百度百科

热心网友 时间：2023-12-01 17:34

最简单的方法，你感兴趣的序列头上取20nt左右，尾巴取20nt左右。注意GC含量大致相同。
专业一点的，可以用软件设计，比如vector NTI

热心网友 时间：2023-12-01 17:34

多数都是你的目的片段的一部分。设计时需要注意很多方面，网上都有介绍，但是要注意的是，他说的20左右个碱基是不包括酶切位点和保护碱基的个数的。